Anales AFA Vol. 31 Nro. 4 (Enero 2021 - Abril 2021) 117-120
https://doi.org/10.31527/analesafa.2020.31.4.117
Física Médica
ESTUDIO PRELIMINAR DEL EFECTO DE AGENTES ANESTÉSICOS EN
LOS PARÁMETROS REOLÓGICOS DE ERITROCITOS GLICADOS
A PRELIMINARY STUDY OF THE EFFECT OF ANESTHETIC AGENTS ON
THE RHEOLOGICAL PARAMETERS OF GLYCATED ERYTHROCYTES
M. V. Batista da Silva
1
, H. Castellini
2
, N. A. Alet
3,4
, B. Riquelme*
1,5
y A. I. Alet
1
1
Área Física, Facultad Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR) - Rosario, Argentina.
2
Departamento de Física, FCEIA (UNR) – Rosario, Argentina.
3
Facultad de Cs. Médicas (UNR) - Rosario, Argentina.
4
Hospital de Emergencias Clemente Álvarez (HECA) - Rosario, Argentina.
5
Grupo de Óptica Aplicada a la Biología, IFIR (CONICET-UNR) - Rosario, Argentina.
Autor para correspondencia: email: riquelme@ifir-conicet.gov.ar, briquel@fbioyf.unr.edu.ar
ISSN 1850-1168 (online)
Recibido: 01/07/2020 Aceptado: 15/07/2020
Resumen:
Este trabajo presenta un estudio preliminar de los efectos de los anestésicos propofol, remifentanilo y
bromuro de vecuronio sobre las propiedades reológicas de eritrocitos glicados in vitro, modelizando la
glicación por hiperglucemia observada en la diabetes. Se determinaron los parámetros viscoelásticos y
de cinética de agregación de los eritrocitos utilizando un reómetro eritrocitario y un agregómetro de
chip óptico desarrollados en nuestro laboratorio. Los resultados mostraron alteraciones significativas en
la viscosidad superficial de membrana, el módulo elástico y el índice de deformabilidad eritrocitaria
para los distintos anestésicos estudiados. También los parámetros de cinética de agregación mostraron
diferente tipo de alteraciones por efecto de los anestésicos. Este estudio preliminar sugiere que el uso
de estos anestésicos en pacientes diabéticos podría inducir alteraciones hemorreológicas que perturben
la microcirculación. Por tal motivo, se recomienda profundizar estas investigaciones a fin de prevenir
complicaciones en procedimientos quirúrgicos.
Palabras clave: viscoelasticidad, agregación eritrocitaria, glicación, anestésicos, diabetes.
Abstract:
This paper presents a preliminary study of the effects of the anesthetics propofol, remifentanil, and
vecuronium bromide on the rheological properties of glycated erythrocytes in vitro, modeling the
glycation by hyperglycemia observed in diabetes. Viscoelastic and aggregation kinetic parameters of
erythrocytes were determined using an erythrocyte rheometer and an optical chip aggregometer
developed in our laboratory. The results showed significant alterations in the membrane surface
viscosity, the elastic modulus, and the erythrocyte deformability index for the different anesthetics
studied. Also, the kinetics aggregation parameters showed different types of alterations due to the effect
of anesthetics. This preliminary study suggests that the use of these anesthetics in diabetic patients
could induce hemorheological alterations that disturb the microcirculation. For this reason, it is
recommended to deepen these investigations to prevent complications in surgical procedures.
Keywords: viscoelasticity, erythrocyte aggregation, glycation, anesthetics, diabetes.
I. INTRODUCCIÓN
La diabetes es un grupo de trastornos que presentan la ausencia relativa o absoluta de insulina, y se
caracteriza por hiperglucemia.
1
Debido a esta condición, los glóbulos rojos (GR) son modificados
químicamente por efecto de la glicación,
2
la cual produce una disminución de la carga eléctrica
superficial negativa.
3
En consecuencia, la glicación de los GR por efecto de la hiperglucemia
disminuye la repulsión electrostática, favoreciendo la agregación eritrocitaria y alterando sus
parámetros hemorreológicos.
4,5
Por otra parte, se ha observado que las técnicas anestésicas pueden afectar los parámetros
hemorreológicos y hemostáticos.
6,7
Los anestésicos aplicados por vía intravenosa más usuales consisten
en una combinación de los anestésicos propofol, remifentanilo y bromuro de vecuronio.
8
El propofol es
un agente hipnótico de corta duración y rápida recuperación anestésica. El remifentanilo se emplea
como analgésico, y para ayudar a la inducción y mantenimiento de la anestesia general. El bromuro de
vecuronio es un bloqueador neuromuscular que no afecta el potencial de membrana.
9
Estudios realizados por Alet et al.
10,11
en muestras de sangre de pacientes diabéticos tratadas in vitro
con propofol describen alteraciones hemorreológicas al comparar con los valores correspondientes a
muestras de dadores sanos. Asociado a esto se encontraron alteraciones en la agregación eritrocitaria,
debidas probablemente a alteraciones de la carga eléctrica superficial y, en menor grado, de la bicapa
lipídica. Además, Batista da Silva et al.
12
encontraron que el propofol puede alterar las propiedades
viscoelásticas dinámicas de la membrana del GR.
Dado que los pacientes diabéticos presentan alteraciones hemorreológicas de base, el uso de
anestésicos podría agravarlas. Por ese motivo la detección y cuantificación de dichas alteraciones antes
de una cirugía, es de gran importancia para poder tomar medidas preventivas y obtener el máximo
beneficio para el paciente.
El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio preliminar de los efectos de agentes anestésicos
(propofol, remifentanilo y bromuro de vecuronio) en GR glicados in vitro simulando el estado de
hiperglucemia in vivo. El estudio se realizó utilizando técnicas ópticas de difractometría láser y de
transmisión láser para determinar parámetros viscoelásticos y de cinética de agregación eritrocitaria.
II. MÉTODOS
Muestras biológicas
Se utilizaron muestras de sangre de dadores sanos (
3n
) obtenidas por punción venosa y
anticoaguladas con EDTA. Posterior a la extracción, los GR se lavaron dos veces con buffer fosfato
salino (PBS: 300 mOsM, pH = 7.4), y se reservó el plasma para uso posterior. La extracción y el
procesamiento de las muestras se realizó según las recomendaciones del panel de expertos en
Hemorreología del Consejo Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH).
13
Glicación in vitro
La glicación no enzimática in vitro difiere de la glicación in vivo, particularmente por los cambios
fisiológicos, el consumo de glucosa y la continua renovación de las células sanguíneas que ocurre en el
cuerpo humano. Por tal motivo, a fin de modelizar in vitro la glicación que se produce in vivo en la
diabetes, se han propuesto diversas técnicas que utilizan distintas concentraciones de glucosa y en las
cuales el tiempo de incubación puede variar desde minutos hasta días.
14–17
En nuestro grupo de
investigación se han realizado ensayos poniendo a punto diversos protocolos en los cuales se analizó el
grado de glicación, y las alteraciones bioquímicas y hemorreológicas de las muestras incubadas con
soluciones de glucosa.
18–22
Teniendo en cuenta las experiencias previas y las condiciones del presente experimento, se estableció
como condición óptima la incubación de volúmenes iguales de GR con una solución de glucosa 0.5%
p/v (equivalente a una glicemia de 250 mg/dL), adicionada con albúmina sérica humana 0.5% v/v en
PBS, durante 5 horas a 37
∘
C con agitación constante. Luego de que los GR fueron incubados, se
lavaron dos veces con PBS. La muestra control (C) consistió en una alícuota de la misma muestra de
sangre, pero utilizando solo PBS durante la incubación.
Tratamiento con anestésicos
Los anestésicos utilizados para la incubación fueron:
• P: propofol (Propofol Gray 10 mg/mL, DR. GREY, Buenos Aires, Argentina).
• R: remifentanilo (5 mg - Fresenius Kabi, L: 76KL521041. Martínez, Buenos Aires - Argentina).
• V: bromuro de vecuronio (Scott Cassara - 10 mg).
Los anestésicos fueron diluidos en forma seriada hasta llegar a la concentración de trabajo en solución
fisiológica. Para realizar el tratamiento in vitro, los GR glicados y sin glicar se suspendieron en plasma
autólogo al 40%, y se incubaron por partes iguales con la solución del anestésico correspondiente en
PBS, siendo la concentración final de incubación la presentada en steady-state durante una cirugía:
• P en 4 μg/mL de plasma.
• R en 10 ng/ml de plasma.
• V en 0.15
g/ml de plasma.
El esquema de incubación consistió en muestras glicadas y sin glicar, tratadas con cada anestésico por
separado (P, R y V) y sus combinaciones (PR, PV y RV) y los respectivos controles. La incubación se
realizó en estufa a 37
∘
C durante 30 minutos bajo agitación suave y constante. Luego, las muestras
fueron centrifugadas a 533 RCF y los GR se lavaron dos veces con PBS. Los GR lavados de cada
muestra fueron suspendidos al 40% en plasma autólogo.
Parámetros viscoelásticos
Para observar los posibles efectos de los anestésicos en los GR glicados analizamos los parámetros
hemorreológicos utilizando el Reómetro Eritrocitario
23,24
(Patente AR 091467 A1, 2013). Este
instrumento se basa en la técnica de difractometría láser y permite obtener los siguientes parámetros
viscoelásticos de los GR en estudio:
25
1. ID: índice de deformabilidad.
2.
: módulo elástico de la membrana del GR.
3.
: viscosidad superficial de la membrana del GR.
Para cada tratamiento los datos fueron obtenidos por quintuplicado.
Parámetros de agregación
Se estudió la cinética de agregación de los GR utilizando el Agregómetro de Chip Óptico
26,27
también
desarrollado en nuestro grupo de investigación y basado en la técnica de transmisión láser. Mediante el
análisis de las curvas obtenidas es posible calcular los siguientes parámetros de agregación eritrocitaria:
1. Amp
1/2
: amplitud de la intensidad luminosa, indicando el grado de agregación de glóbulos rojos.
2. t
1/2
: tiempo necesario para alcanzar la mitad intensidad de la luz Amp
1/2
, lo que indica la
constante de tiempo característica para el nivel de agregación en un momento dado.
Análisis estadísticos
Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de Student utilizando Scientific
Python. Se consideraron que las diferencias son significativas
28
cuando el
p
-valor de comparación
contra el control (C) correspondiente fue
0.05p
.
III. RESULTADOS
En la Tabla 1 se presentan los valores medios de los parámetros viscoelásticos de los GR controles,
glicados, y tratados con los diferentes anestésicos, solos y en combinación. En la Tabla 2 se presentan
los parámetros de cinética de agregación t
1/2
y la Amp
1/2
normalizados al control correspondiente,
para las muestras sin glicar y para las muestras glicadas. Todos los resultados son presentados como
Media ± SD.
TABLA 1: Parámetros Viscoelásticos de GR de muestras glicadas y no glicadas incubadas con los
anestésicos. DND: dato no determinado. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.
TABLA 2: Parámetros de cinética de agregación de las muestras glicadas y no glicadas incubadas con
los anestésicos. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.
IV. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
En la Tabla 1 se observa que los valores de
aumentaron significativamente en las muestras no
glicadas tratadas con PR y PV (
0.05p
;
0.001p
). También se observó un aumento de
para las
muestras glicadas tratadas con V (
0.001p
). Por el contrario, el tratamiento con R disminuyó
levemente la viscosidad en los GR de las muestras no glicadas (
0.01p
).
En los GR no glicados el
disminuyó para los tratados con R y RV (
0.05p
) indicando una
disminución en la rigidez de la membrana eritrocitaria por la acción de dichos anestésicos. En cambio,
se observó un aumento de
debido al tratamiento con P y PR (
0.01p
;
0.05p
). Para los GR
glicados no hubo variaciones significativas de
, indicando un posible efecto protector de la glucosa a
la concentración utilizada.
Los valores de ID estuvieron aumentados significativamente para los GR no glicados y glicados
tratados con R y RV (
0.01p
). En cambio, el P presentó una leve disminución del ID la cual fue
significativa solo para las muestras glicadas (
0.05p
).
La Tabla 2 presenta los resultados obtenidos de los parámetros de cinética de agregación. El t
1/2
de los
GR no glicados presentaron un aumento significativo para los tratamientos con P y R (
0.001p
;
0.05p
) y una disminución significativa para los tratados con PR y PV (
0.05p
), indicando que los
anestésicos modificarían la velocidad de agregación de los GR. Por otro lado, la Amp
1/2
presentó un
aumento significativo solo para las mezclas PR y PV (
0.05p
).
Los GR glicados tratados con P, R y PR mostraron una disminución significativa en el t
1/2
(
0.05p
). La Amp
1/2
también presentó un aumento significativo para los GR glicados tratados con P, R y PR
(
0.05p
).
V. CONCLUSIÓN
Los resultados obtenidos muestran que los anestésicos podrían afectar los parámetros viscoelásticos de
GR glicados de diferentes maneras. Se observan alteraciones similares a las encontradas previamente
por Alet et al.
11
por la acción del P. El estudio sobre los anestésicos V y R también mostraron
alteraciones significativas de la viscosidad superficial de membrana, del módulo elástico y del ID. Este
resultado es de importancia dado que Lupton et al.
8
señalan que esos anestésicos junto con el propofol
forman la combinación más utilizada en procedimientos quirúrgicos. Los resultados obtenidos con el
agregómetro de chip óptico también mostraron alteraciones significativas por efecto de los anestésicos
en los GR incubados con la concentración de glucosa equivalente a una glicemia de 250 mg/dL.
Si bien este es un estudio preliminar, los resultados obtenidos son una importante contribución para la
evaluación de la prevención de complicaciones en procedimientos quirúrgicos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Universidad Nacional de Rosario por el apoyo financiero para esos estudios
a través del proyecto BIO604. El primer autor agradece al Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas (CONICET) por la beca doctoral.
REFERENCIAS
[1] A. C. Powers. Diabetes mellitus: diagnóstico, clasificación y fisiopatología en K Dennis, Fauci A,
Hauser S, et al. Harrison Principios de Medicina Interna. (19ed. McGraw-Hill Interamericana Editores,
S.A., 2016).
[2] G. Basta, A. M. Schmidt y R. De Caterina. Advanced glycation end products and vascular
inflammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes. Cardiovasc. Res. 63, 582-592
(2004).
[3] S. Kelm y R. Schauer. Sialic acids in molecular and cellular interaction. Int. Rev. Cytol. 175, 137-
240 (1997).
[4] N. Lebensohn, A. Re, L. Carrera, L. Barberena, M. D´Arrigo y P. Foresto. Ácido siálico sérico,
carga aniónica y agregación eritrocitaria en pacientes diabéticos e hipertensos. Medicina 3, 331-334
(2009).
[5] Y. I. Cho, M. P. Mooney y D. J. Cho. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J Diabetes
Sci Technol. 2, 1130-1138 (2008).
[6] A. Alet, M. Chiesa, L. Racca, M. D’Arrigo, P. Foresto, J. Valverde y R. Rasia. Hemorreología
comparativa. Estudios en diabéticos e hipertensos. Acta Bioq Clin Lat 35, 63-68 (2001).
[7] C. Pinnock, T. Lin y T. Smith. Fundamentals of Anesthesia (3 ed. Cambridge University Press,
2009).
[8] T. Lupton y O. Pratt. Fármacos endovenosos utilizados para indução anestésica. Sociedade
Brasileira de Anestesiologia, 1-10 (2013).
[9] R. L. Videira y J. R. Cruz. Remifentanil in the Clinical Practice. Rev Bras Anestesiol. 54, 114-128
(2004).
[10] A. I. Alet, S. S. Basso, H. V. Castellini, M. Delannoy, N. Alet, M. D’Arrigo y B. D. Riquelme.
Hemorheological in vitro action of propofol on erythrocytes from healthy donors and diabetic patients.
Clin Hemorheol Microcirc. 64, 157-165 (2016).
[11] A. Alet, N. Alet, M. Delannoy, A. Fontana y B. Riquelme. In vitro study of rheological effects of
propofol on human erythrocyte membrane. Series on Biomechanics 27, 39-44 (2012).
[12] M. Batista da Silva, A. Alet, N. Alet, H. Castellini, M. D’Arrigo y B. Riquelme. Alteration of red
blood cells viscoelastic properties by in vitro action of Propofol. Series on Biomechanics 31, 25-29
(2017).
[13] O. Baskurt, M. Hardeman, M. Rampling y H. Meiselman. Handbook of Hemorheology and
Hemodynamics (1 ed. Amsterdam: IOS Press, 2007).
[14] J. E. Raftos, A. Edgley, R. M. Bookchin, Z. Etzion, V. L. Lew y T. Tiffert. Normal Ca2+ extrusion
by the Ca2+ pump of intact red blood cells exposed to high glucose concentrations. Am J Physiol Cell
Physiol. 280, C1449-C1454 (2001).
[15] R. Nagai, E. K. Deemer, J. W. Brock, S. R. Thorpe y J. W. Baynes. Effect of glucose
concentration on formation of AGEs in erythrocytes in vitro. Ann N Y Acad Sci. 1043, 146-150
(2005).
[16] H. Resmi, H. Akhunlar, A. Temiz Artmann y G. Güner. In vitro effects of high glucose
concentrations on membrane protein oxidation, G-actin and deformability of human erythrocytes. Cell
Biochem Funct. 23, 163-168 (2005).
[17] G. S. D. Lemos, L. F. Márquez-Bernardes, L. R. Arvelos, L. F. Paraíso y N. Penha-Silva.
Influence of glucose concentration on the membrane stability of human erythrocytes. Cell Biochem
Biophys 61, 531-537 (2011).
[18] B. Riquelme, P. Foresto, M. D’Arrigo, J. Valverde y R. Rasia. A dynamic and stationary
rheological study of erythrocytes incubated in a glucose medium. J Biochem Biophys Meth 62, 131-
141 (2005).
[19] A. Brandoni, A. Rojas, B. Riquelme, P. Foresto, M. D’Arrigo, J. Valverde y R. Rasia. Influence of
membrane protein no-enzymatic glycosilation in the erythrocyte surface properties. Biocell 25, 206
(2001).
[20] A. Korol, O. Rosso, M. Martín, M. D’Arrigo y B. Riquelme. Impairment of erythrocytes incubated
in glucose medium: a wavelet-information theory analysis. Cell Biochem Biophys. 60, 329-334 (2011).
[21] A. Korol, B. Riquelme y M. D’Arrigo. Crossover from Weak to Strong Nonlinear Disorder in the
Viscoelasticity of Glucose Incubated Erythrocytes. Open J Biophys 3, 191-197 (2013).
[22] P. Buszniez, H. Mascaro Grosso, R. Pusillico, M. D’Arrigo y B. Riquelme. Relationship between
glucose consumption and alteration in erythrocyte aggregation in a nonenzymatic glycosylation model
in vitro. Biocell 43, A13 (2019).
[23] B. Riquelme, H. Castellini y B. Albea. Linear and nonlinear viscoelasticity of red blood cells using
a New Optical Erythrocyte Rheometer. Latin America Optics and Photonics Conference, Th4A.41
(2018).
[24] B. Riquelme, J. Valverde y R. Rasia. Complex viscoelasticity of normal and lectin treated
erythrocytes using laser diffractometry. Biorheology 35, 325-334 (1998).
[25] B. Riquelme, P. Foresto, M. D’Arrigo, F. Filippini y J. Valverde. Laser diffractometry technique:
clinical applications to vascular pathologies. Clin Hemorheol Microcirc. 35, 277-281 (2006).
[26] M. A. Toderi, B. D. Riquelme y H. V. Castellini. Simplified variant of an optical chip to evaluate
aggregation of red blood cells. Biophotonics South America, Proc. SPIE 9531, 95313X (2015).
[27] M. A. Toderi, H. V. Castellini y B. D. Riquelme. Descriptive parameters of the erythrocyte
aggregation phenomenon using a laser transmission optical chip. J Biomed Opt. 22, 017003 (2017).
[28] J. Devore. Probabilidad y estadística para ingeniería y ciencias (7 ed. México, Editorial
Latinoamericana, 2013).
