Anales AFA Vol. 34 Nro. 2 (Junio 2023 - Septiembre 2023) 42-45
https://doi.org/10.31527/analesafa.2023.34.2.42
Física Médica
EFECTO DE EXTRACTOS ACUOSOS DE Phyllanthus sellowianus SOBRE LAS
PROPIEDADES VISCOELÁSTICAS DE GLÓBULOS ROJOS HUMANOS: ACTIVIDAD
ANTIDIABÉTICA IN VITRO
EFFECT OF AQUEOUS EXTRACTS OF Phyllanthus sellowianus ON THE VISCOELASTIC
PROPERTIES OF HUMAN RED BLOOD CELLS: IN VITRO ANTIDIABETIC ACTIVITY
H. Mascaro Grosso 1, P. Buszniez 1, H. V. Castellini 2, B. D. Riquelme * 1,3
1Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas – Universidad Nacional de Rosario – Suipacha 535 – (2000)
Rosario – Argentina
2Fac. Cs. Exactas, Ingeniería y Agrimensura – Universidad Nacional de Rosario – Pellegrini 250 –
(2000) Rosario – Argentina
3Grupo de Física Biomédica – IFIR (CONICET-UNR) – Bv. 27 de febrero 210 bis – (2000) Rosario
– Argentina
Autor para correspondencia: * riquelme@ifir-conicet.gov.ar, briquel@fbioyf.unr.edu.ar
Recibido: 13/12/2022; Aceptado: 27/02/2023
ISSN 1850-1168 (online)
Resumen
El Phyllanthus sellowianus Müll (Klotzch) Arg. es una planta nativa utilizada popularmente para el
tratamiento de la diabetes. Actualmente es de interés evaluar su actividad sobre las propiedades me-
cánicas de los glóbulos rojos humanos a fin de elucidar su mecanismo de acción como antidiabético.
Para ello se prepararon extractos acuosos por diversas técnicas extractivas. Utilizando el Reómetro
Eritrocitario se evaluó el efecto in vitro sobre los parámetros viscoelásticos de glóbulos rojos hu-
manos glicados, como ocurre por la hiperglucemia en la diabetes. Los resultados obtenidos sobre el
tratamiento con los extractos muestran que afectan la viscoelasticidad eritrocitaria y pueden revertir
los efectos de la glicación.
Palabras clave: Phyllanthus sellowianus, viscoelasticidad eritrocitaria, diabetes.
Abstract
Phyllanthus sellowianus Müll (Klotzch) Arg. is a native plant used for diabetes treatment. It is cu-
rrently of interest to evaluate its activity on the mechanical properties of human red blood cells to
elucidate its mechanism of action as an antidiabetic. For this, aqueous extracts were prepared by va-
rious extractive techniques. Using the Erythrocyte Rheometer, the in vitro effect on the viscoelastic
parameters of glycated human red blood cells, as occurs by hyperglycemia in diabetes, was evaluated.
The results obtained from the treatment with the extracts show that they affect erythrocyte viscoelas-
ticity and can reverse the glycation effects.
Keywords: Phyllanthus sellowianus; erythrocyte viscoelasticity, diabetes.
1. INTRODUCCIÓN
El sarandí blanco (Phyllanthus sellowianus) es un arbusto hidrófilo de la familia de las filantáceas
usado popularmente para el tratamiento de la diabetes. El uso de esta especie como apoyo al trata-
miento de la diabetes figura en la Farmacopea Argentina [1], siendo de interés actual el estudio de
su mecanismo de acción y su hemocompatibilidad para futuros usos terapéuticos [2,3]. La diabetes
1
FIG. 1: Ejemplar de las hojas y flor de Phyllanthus sellowianus recolectado en la ribera del río Nogoyá, Entre
Ríos. Argentina.
mellitus es actualmente una de las principales amenazas para la salud humana. Esta enfermedad se
caracteriza por la hiperglucemia la cual produce la glicación de los glóbulos rojos, alterando sus pro-
piedades mecánicas y de agregación [4,5]. Estas alteraciones hemorreológicas inducen alteraciones
en la microcirculación ocasionando complicaciones como por ejemplo los accidentes cerebrovascu-
lares, la ceguera y el pie diabético.
La glicación que ocurre en los glóbulos rojos por efecto de la hiperglucemia, puede ser satisfacto-
riamente modelizada in vitro a través de diversos protocolos [6,7].
El objetivo de este trabajo es estudiar las alteraciones de los parámetros viscoelásticos de glóbulos
rojos humanos glicados in vitro e incubados con extracto de hojas y corteza de Phyllanthus sellowia-
nus obtenidos por distintos métodos de extracción (infusión, cocimiento, digestión y maceración).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Recolección del material vegetal
Se recolectaron hojas y tallos de árboles de Phyllanthus sellowianus en estado adulto (Fig. 1) en
el sarandisal que se encuentra en la zona ribereña de Nogoyá, en el parque Paseo de Los Puentes,
Ruta Nacional 12, la planta se encuentra distribuida en la margen del río Nogoyá, Entre Ríos. La
recolección se realizó en la primavera (02/03/2019).
2.2. Extractos de Phyllanthus sellowianus
Se seleccionaron las hojas y leño de Phyllanthus sellowianus recolectado, las cuales fueron seca-
das por método natural y almacenadas en bolsas opacas de papel. Luego, el material seco fue triturado
para la preparación de los extractos a una concentración del 5% (Fig. 2). Para ello, se suspendieron
3 g del material vegetal triturado en 57 mL de solución fisiológica, para uso intravenoso (Laboratorio
B. Braun Medical S.A; pH 7,4 y 308 mOsm/L) a fin de que tuvieran el pH y la osmolaridad ade-
cuadas para la incubación posterior con los GR humanos. Los extractos se obtuvieron utilizando las
siguientes técnicas extractivas:
Maceración (M): El material vegetal se colocó en contacto con el disolvente, dejando actuar
durante 12 horas a temperatura ambiente al abrigo de la luz.
Infusión (I): Se llevó el disolvente a ebullición (100◦C), y se colocó el material vegetal en contacto
con él hasta alcanzar la temperatura ambiente.
Digestión (D): El material vegetal y el disolvente se colocaron en contacto dentro de un reci-
piente de vidrio. Luego, el recipiente con su contenido fue colocado a Baño María hasta alcanzar la
temperatura de 40◦C, la cual fue mantenida durante 20 minutos.
Cocimiento (C): Se colocó el material vegetal en contacto con el disolvente y se llevó a 100◦C
durante 5 minutos. Se agregó agua destilada a fin de compensar la pérdida por evaporación, y mantener
2
el volumen y la osmolaridad constante.
Luego se procedió al proceso de filtración de los extractos para eliminar impurezas de diámetros
superiores a 0,2 µm (Filtros Marca Acrodisc 25 mm), así como también esterilizar las distintas solu-
ciones obtenidas. El proceso de filtración se realizó en tubos estériles y bajo flujo laminar (o mechero),
adoptando las precauciones normales para trabajar en condiciones estériles.
Dado que los extractos presentaron características ácidas y osmolaridad fuera del rango [2] de las
condiciones fisiológicas necesarias, se procedió a la corrección llevándolos a pH 7,4 y 300 mOsm/L
para que pudieran ser enfrentados con glóbulos rojos humanos.
Finalmente, las soluciones fueron fraccionadas, rotuladas adecuadamente y almacenadas a 4◦C.
2.3. Muestras de glóbulos rojos humanos
Se utilizaron muestras de glóbulos rojos (GR) de dadores sanos (n = 3) obtenidas por punción ve-
nosa y anticoaguladas con EDTA-K3. La extracción y el procesamiento de las muestras se realizaron
bajo las normas de Bioseguridad e Higiene de la FCByF (UNR) y con el cumplimiento de las corres-
pondientes reglamentaciones de Bioética de las instituciones involucradas (Res. Nº 347/2013 de 18 de
junio de 2013). Los dadores eran adultos masculinos entre 25 y 35 años de edad, no fumadores y que
no consumían ningún tipo de medicación. Las muestras fueron procesadas inmediatamente luego de
la extracción y las determinaciones se realizaron de acuerdo con las recomendaciones Internacionales
[1]. La sangre entera fue centrifugada a temperatura ambiente, 5 minutos a 2000 rpm (centrífuga Pa-
rawall modelo PWL12T), para separar el plasma autólogo y eliminar la capa leucoplaquetaria. Luego
los GR fueron lavados dos veces con solución buffer fosfato (PBS, 7,4, 300 mOsm/L).
2.4. Obtención de glóbulos rojos glicados (GRg)
Una alícuota de los GR lavados fue incubada durante 2 horas en volúmenes iguales con una solu-
ción de glucosa (dextrosa, C6H12O6, Biopack, Lote: 16882015) al 0,4 g/dL en PBS a fin de simular
in vitro la hiperglicemia que ocurre en un paciente diabético (de 200 mg/dL), obteniendo los glóbulos
rojos glicados (GRg). Otra alícuota de los GR lavados fue incubada en las mismas condiciones solo
con PBS para ser utilizada como control. Luego, ambas muestras fueron lavadas con PBS para el
posterior tratamiento con los extractos vegetales.
2.5. Incubación de los GR y GRg con los extractos
Las muestras de GR (control) y los GRg fueron incubadas en volúmenes iguales con cada extracto
vegetal (M,I,DyC) durante 1 hora con agitación suave y controlada a 37◦C. Luego, los eritrocitos
control, los glicados y los tratados con los extractos (GR+M,GR+D,GR+I,GR+CyGRg,GRg+M,
GRg+D,GRg+I,GRg+C) fueron lavados con PBS y suspendidos en plasma autólogo al 40 % para
las determinaciones reológicas.
FIG. 2: Material vegetal triturado y procedimiento de obtención del cocimiento.
3
2.6. Equipamiento y métodos
La evaluación de las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos fue realizada utilizando el
Reómetro Eritrocitario por quintuplicado. El Reómetro Eritrocitario [8,9] se basa en la técnica de
difractometría láser, es un nuevo instrumento desarrollado en el Laboratorio del Grupo de Física
Biomédica del Instituto de Física Rosario (IFIR - CONICET/UNR). Este instrumento en régimen es-
tacionario realiza un ensayo de Carga o Creep, donde se registran los datos luego de arrancar el motor,
y un ensayo de Descarga o Relajación, donde se obtienen datos inmediatamente después de detener
el motor. A partir de las curvas de carga y descarga obtenidas para cada muestra, se calculan los pará-
metros característicos al régimen estacionario. Para ello, la curva de descarga obtenida se ajusta a una
curva de decaimiento exponencial obteniendo el tiempo de retardo o relajación (tr). La parte inicial
de la curva de carga se ajusta con una función lineal, teniendo así la pendiente, necesaria para calcular
el módulo elástico (µ) y la viscosidad superficial de membrana (ηm). La tensión de corte es un dato
del equipo, mientras que la deformación máxima se determina de la curva de carga. Conociendo el
valor de la contante elástica es posible conocer el valor de la constante viscosa a través del tiempo
de relajación, que se calcula por medio de la curva de descarga. Por lo tanto, a partir de la señal
registrada correspondiente a los glóbulos rojos durante el proceso de deformación se determinan los
siguientes parámetros relacionados con la capacidad de deformación de los glóbulos rojos sometidos
a una tensión de corte estacionaria [10]:
índice de deformabilidad eritrocitario
ID =(A1−A3)
(A1+A3)(1)
donde A1yA3son las lecturas fotométricas tomadas a lo largo de los ejes mayor y menor del
patrón elíptico de difracción.
módulo elástico de la membrana
µ=τFSo
4·A1·A3
A1
−A1
A3(2)
donde τFes la tensión final a la que están sometidos los glóbulos rojos y S0es la superficie
inicial del eritrocito en reposo.
viscosidad superficial de la membrana
ηs=µ·tr(3)
Siguiendo el protocolo establecido para el uso de este instrumento, se determinaron los paráme-
tros viscoelásticos de los glóbulos rojos controles, los glicados, y los tratados con los distintos
extractos.
2.7. Análisis estadístico
Las determinaciones fueron realizadas en cada muestra por quintuplicado utilizando el Reómetro
Eritrocitario. Todos los resultados fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de Student
utilizando el software InfoSAT. Se consideró que las diferencias eran significativas cuando el p-valor
de comparación con el Control (correspondiente a los glóbulos rojos incubados solo con PBS) fue p
<0.05.
4
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Tabla 1se presentan los valores medios ±los desvíos estándares de los parámetros viscoe-
lásticos de los glóbulos rojos glicados (GRg) simulando el efecto que produce la hiperglucemia en la
diabetes, e incubados con las distintas soluciones extractivas.
TABLA 1: Parámetros viscoelásticos estacionarios de los glóbulos rojos glicados tratados con Phyllanthus
sellowianus.
ID ηm
10−7N.s/m
µ
10−6N/m
Control 0,62 ±0,02 1,8±0,2 4,8±0,3
GRg 0,63 ±0,02 2,4±0,2∗ ∗ 4,7±0,3
GRg+M 0,64 ±0,01 1,8±0,44,7±0,1
GRg+D 0,60 ±0,02 2,1±0,2∗4,8±0,5
GRg+I 0,61 ±0,02 1,6±0,2∗∗ 4,8±0,5
GRg+C 0,62 ±0,02 2,1±0,3 4,8±0,5
*P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001
Los resultados de la Tabla 1no mostraron diferencias significativas con respecto al control en el
índice de deformabilidad ni en el módulo elástico de la membrana de los glóbulos rojos para ninguna
de las muestras tratadas. Los valores de la viscosidad superficial de membrana de las muestras de
glóbulos rojos glicados (valor indicado en rojo en la Tabla 1) fueron significativamente superiores al
control (p <0,01). En cambio, las muestras de glóbulos rojos glicados y tratadas con los extractos de
Phyllanthus sellowianus presentaron valores de viscosidad superficial de membrana más cercanos al
control, especialmente la muestra de glóbulos rojos glicados incubada con el extracto de maceración
presentó el mismo valor del control (valor indicado en verde en la Tabla 1).
4. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este trabajo indican que el tratamiento in vitro con los extractos de
Phyllanthus sellowianus revertirían los efectos de la glicación sobre la viscoelasticidad eritrocitaria
en situaciones similares a la de la hiperglucemia que ocurre en la diabetes. Por lo tanto, este estudio
brindaría información de gran importancia para la comprensión de los mecanismos de acción por los
cuales el Phyllanthus sellowianus, o sus componentes químicos, son utilizados como antidiabéticos
en fitomedicina.
REFERENCIAS
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y reológica de soluciones extractivas de phyllanthus sellowianus y bauhinia forficata. Anales AFA 28,
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[3] P. Buszniez, O. Di Sapio y B. Riquelme. Effects of Phyllanthus sellowianus Müll Arg. Extracts on the
Rheological Properties of Human Erythrocytes. Cell Biochem. Biophys. 70, 1407-1416 (2014).
[4] B. Riquelme, P. Foresto, M. D’Arrigo y R. Rasia. Laser diffractometry technique for determination
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Coherence Tomography and Coherence Techniques (OSA, 2003), 5140.
[5] M. Delannoy, A. Fontana, M. D’Arrigo y B. Riquelme. Influence of hypertension and type 2 diabe-
tes mellitus on erythrocyte aggregation using image digital analysis. Series on Biomechanics 29, 5-10
(2015). https://www.imbm.bas.bg/biomechanics/uploads/Archive2015-1/5-10_Delannoy.pdf.
[6] B. Riquelme, P. Foresto, M. D’Arrigo, J. Valverde y R. Rasia. A dynamic and stationary rheological
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[8] B. Riquelme, H. Castellini y B. Albea. Linear and Non-linear Viscoelasticity of Red Blood Cells using
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548-778-992. Patente de Invención AR 091467 B1. 2013.
[10] B. Albea. Construcción y validación de un Reómetro Eritrocitario Tesis lic. (Facultad de Cs. Bioquími-
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6
