Anales AFA Vol. 34 Nro. 4 (Diciembre 2023 - Marzo 2024) 87-91
DISEÑOS DE MICRODISPOSITIVOS EFICIENTES PARA SEPARACIÓN DE
COANOFLAGELADOS
EFFICIENT MICRODEVICES DESIGNS FOR CHOANOFLAGELLATES SEPARATION
L. Guzman Vazquez *1, G. Miño 2,3, A. Banchio 1,4 y V. Marconi**1,4
1Facultad de Matemática, Astronomía, Física y Computación - Universidad Nacional de Córdoba
Av. Medina Allende S/N, X5000HUA, Córdoba, Argentina
2Laboratorio de Microscopía Aplicada a Estudios Moleculares y Celulares (LAMAE) y Grupo de Investigación en Microfluídica
(GIM), Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Entre Ríos (FIUNER),
Ruta prov 11 km 10 Oro Verde, Paraná, Entre Ríos, Argentina
3Instituto de Investigación y Desarrollo en Bioingeniería y Bioinformática (IBB, CONICET-UNER),
Ruta prov 11 km 10 Oro Verde, Paraná, Entre Ríos, Argentina
4Instituto de Física E. Gaviola, IFEG-CONICET
Av. Medina Allende S/N, X5000HUA, Córdoba, Argentina
Recibido: 28/06/2023; Aceptado: 28/08/2023
Los coanoflagelados son microorganismos de gran interés en biología evolutiva, debido a que son considerados los
ancestros más cercanos al reino animal. En particular, en su forma unicelular desarrollan fenotipos con diferentes ca-
racterísticas en cuanto a la forma de nado, con la capacidad de producir gametas sexuadas bajo ciertas condiciones nu-
tricionales. Basados en el trabajo teórico de Sparacino et al.,J. Phys. D: Appl. Phys. (2020), se propuso y se exploraron
nuevos diseños de dispositivos microfluídicos, atendiendo a las restricciones de la microfabricación y las observaciones
por microscopía. A través de un modelo fenomenológico, adaptado a la dinámica de coanoflagelados unicelulares en
un microdispositivo asimétrico, se logró separar a las células rápidas, reconcentrándolas hasta 8 veces. Esto se alcanzó
dentro de una ventana temporal que minimiza la variación biológica de las muestras, siendo independiente de la geo-
metría. Además, se exploraron nuevas aplicaciones biotecnológicas para modelar distintos comportamientos biológicos
relacionados a las respuestas de taxis que experimenta una célula. Se observó que las poblaciones con menor tasa de
cambio direccional, son concentradas con mayor eficiencia en el microdispositivo propuesto.
Palabras Clave: coanoflagelados, separador, microfluídica, confinamiento.
Choanoflagellates are microorganisms of great interest in evolutionary biology because they are considered to be the
closest living relatives to animals. In their unicellular form, they developed phenotypes with different swimming stra-
tegies and the ability to produce sexual gametes. Based on the work of Sparacino et al.,J. Phys. D: Appl. Phys. (2020),
new designs of microfluidic devices were proposed and explored with consideration to both microfabrication restrictions
and microscopy observation limitations. Through a phenomenological model, adapted to the dynamics of unicellular
choanoflagellates in an asymmetric microdevice, it was possible to separate the fast cells, reconcentrating them up to 8
times. It was observed in a temporal window independent of the geometry, minimizing the biological variation of the
samples. Furthermore, new biotechnological applications were explored to model different biological behaviors related
to the taxis responses experienced by a cell. It was noted that populations with lower change of direction are efficiently
concentrated in the proposed microdevice.
Keywords: choanoflagellates, sorter, microfluidics, confinement.
https://doi.org/10.31527/analesafa.2023.34.4.87 ISSN 1850-1168 (online)
* laraguzmanvazquez@gmail.com ** vmarconi@famaf.unc.edu.ar
©2023 Anales AFA
I. INTRODUCCIÓN
Los coanoflagelados son microorganismos unicelulares pertenecientes al grupo de las eucariotas que se encuentran en
aguas dulces y ambientes marinos [1].Tal como indica su nombre, estos poseen un collar o cono de microvellosidades
que rodean a un único flagelo, el cual constituye su motor de autopropulsión [2]. Además, éstas células poseen relevancia
ecológica, ya que al ser bacteriovoros, contribuyen en la disponibilidad de materia orgánica y el ciclo de carbono en
ambientes acuosos. Por otra parte son considerados los ancestros más cercanos en la evolución animal [3-5].
20µm
lf~200μm lg~10μm
cámara 2
6mm
cámara 1
3mm
nadador lento nadador rápido
2lf
FIG. 1: A izquierda se grafican los micronadadores lentos y rápidos. El círculo con línea de puntos sobre el micronadador rápido
corresponde al cuerpo del micronadador lento. Debajo de los mismos se muestran las trayectorias reales de los lentos (tortuosas) y
rápidos (rectas). En el centro, se tiene un sketch del microdispositivo propuesto y simulado. El mismo posee No= 6 obstáculos que
separan las cámaras 1y2. Su dimensión es de 3×6 mm y dentro del mismo se esquematiza el círculo de inoculación. En el panel
derecho, se agranda la abertura de ancho lg(flecha grande). Las flechas grises indican el sentido fácil de transporte celular. Para
mejor visualización los puntos que representan los micronadadores están magnificados 4 veces de su tamaño real y simulado.
Este trabajo se enfoca en la especie Salpingoeca Rosetta, la cual se puede encontrar agrupada en colonia (rosetas o en
cadena) o en forma unicelular. En esta última bajo determinadas condiciones ambientales, que pueden ser replicadas en
cultivo in vitro, coexisten dos poblaciones con morfología y dinámica de nado muy distintas: los micronadadores rápidos
y lentos (Fig. 1). Los micronadadores rápidos describen trayectorias más rectilíneas y poseen cuerpos más elipsoidales con
un collar de microvellosidades reducido en comparación con los micronadadores lentos que dibujan trayectorias tortuosas,
con cuerpos más esféricos y de mayor tamaño(ver Tabla 1).
Una particularidad que engloba a esta especie es el aumento o disminución en la probabilidad de fusión celular de
gametas o células sexuadas debido a la variación en la disponibilidad de nutrientes de su ambiente. En otras palabras, bajo
hambruna estos microorganismos tienden a unirse para preservar su supervivencia y su información genética de tal forma
que cumplen con la función de gametas masculinas y femeninas. En la actualidad, se desconoce si existe alguna conexión
entre el tipo de micronadador y el tipo de gameta [6].
Haciendo foco en su individualidad, separar y concentrar ambas poblaciones ayudaría a realizar estudios genéticos para
entender la función de cada micronadador, y en un futuro, el de las colonias. Si bien se han explorado numéricamente
algunas configuraciones de dispositivos de separación [7], éstos no son reproducibles experimentalmente debido al gran
tamaño dimensional y las limitaciones de observación mediante técnicas microscópicas.
Este trabajo explora los fenómenos de transporte celular en microdispositivos reales para determinar los parámetros
geométricos que permitan una optimización en la separación celular. El dispositivo microfluídico planteado posee micro-
obstáculos asimétricos quasi 2D, que generan una ruptura de simetría y una dirección de nado preferencial. Esto junto a la
diferencia en la dinámica de los micronadadores, se espera que conjuntamente contribuyan a dar lugar a una separación de
ambas poblaciones en un tiempo experimental realista. Es decir, en un tiempo en el cual se preserve la salud del modelo
biológico y sea factible para el manejo del operador de laboratorio.
En la sección II se específica el microdispositivo y el modelado. En la sección III se presentan los resultados teóricos.
Por último en la sección IV se darán las conclusiones y detalles del trabajo a futuro.
II. FÍSICA DEL MODELO BIOLÓGICO Y METODOLOGÍA
El objetivo de las simulaciones es representar la dinámica de ambas poblaciones de coanoflagelados bajo confinamiento.
Para ello, se propone un modelo fenomenológico cuasi-2D siguiendo las consideraciones del trabajo de J. Sparacino et
al. [7].
Las siguientes ecuaciones de movimiento para ambos micronadadores, corresponden a un modelo hidrodinámico lineal
de Stokes. Son resueltas en simultáneo con la dinámica de Langevin en dos dimensiones, confinadas en un microdisposi-
tivo.
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γ˙
ri=Fm
i+Fss
i+Fsw
iγ=4πRη(1)
˙
θi=p2Drζi(2)
Donde ˙ri= ( ˙xi,˙yi)es la velocidad resultante del centro de masa del i-ésimo coanoflagelado, R es el radio del nadador y η
es la viscosidad del medio. ˙
θes la velocidad del cambio de dirección de nado y Dres el coeficiente de difusión rotacional.
Siguiendo las consideraciones del trabajo de J. Sparacino et al. [7], la dirección de nado, θ, tiene dos contribuciones.
Una para cada paso temporal y la otra es regida por una distribución de Poisson con un tiempo medio de cambio de
dirección, τCHD , aleatorio entre [−π,π]. Este último es un valor fenomenológico y realista obtenido de análisis de datos
de experimentos previos [8] como lo son el radio del microorganismo R, el tiempo medio de cambio de dirección, τCHD , y
la velocidad media, ⟨v⟩, de la Tabla 1.
rápido lento
N1582 558
⟨v⟩[µm/s] 60 ±10 15 ±5
R[µm] 1.25 2.5
Dr[rad2/s] 0.02 0.5
τCHD [s] 10 10
TABLA 1: Parámetros de la movilidad utilizados en las simulaciones para ambas poblaciones. Siendo N el tamaño poblacional, ⟨v⟩la
velocidad media, R el radio del cuerpo del nadador, Drel coeficiente de difusión rotacional y τCHD el tiempo promedio de cambio de
dirección.
El microdispositivo utilizado en las simulaciones, consiste en un rectángulo de 3×4.5mm, con vértices redondeados de
radio interno 100.5 µm, unido con un medio círculo de radio interno 1.5mm (ver panel central de la Fig. 1). La sección
rectangular contiene Nomedios círculos de radio lfpuestos en serie con un ancho de pared wwy de obstáculos wf,
separados por una abertura fija lgtal como se visualiza en el zoom superior derecho de la Fig. 1.
Este arreglo de obstáculos permite dividir la sección rectangular en dos cámaras; la cámara 1 representada con un fondo
blanco, con un área A1, y la cámara 2 con un fondo azul con un área A2. La finalidad de estos obstáculos es poder, a través
de la ruptura de simetría y gracias al nado celular por las paredes, separar ambas poblaciones [7].
En el trabajo de J. Sparacino et al. [7] se propuso un microdispositivo similar; manteniendo el número de obstáculos
(No=10), se varió el tamaño del área a través del radio de los obstáculos Roo el tamaño de las aberturas lg, respetando
la ley de escala. Se consideraron tamaños de dispositivos (entre 500 µm a 10000 µm) demasiado grandes en relación a
la resolución espacial para detectar una célula (del orden de las micras). Por otro lado, el sistema modelado impide la
inoculación experimental ya que no cuenta con un acceso para la inoculación de células.
El presente trabajo se centra en un microdispositivo con un tamaño límite de cámara, siendo de un ancho fijo Lx=3mm
y un largo fijo Ly=6 mm. A su vez, se agrega una cámara de inoculación para facilitar la inserción de la población al
microdispositivo. Se representa la condición inicial en la Fig. 1.
Dada la restricción en el ancho de la cámara, el radio de los obstáculos, lf, está dado por Ec. (3).
lf=Lx−(No−1)(lg+2wf)2
No
(3)
con Noel número de obstáculos, lgtamaño de la abertura y wfel ancho de pared del obstáculo. De esta manera se puede
estudiar el efecto de ruptura de simetría en la rectificación variando el número de obstáculos No.
Los dispositivos que generan un efecto ratchet son denominados rectificadores y son aquellos que pueden direccionar
a una población, en este caso de microorganismos, sin la necesidad de utilizar campos externos o gradientes. Una forma
de medir la eficiencia de este efecto es a través de la rectificación, que se define como el cociente entre las densidades de
la cámara 2 y la cámara 1, Ec. (4).
r(t) = ρ2(t)
ρ1(t)=N2(t)A1
A2N1(t)(4)
Con Ni(t)el número de coanoflagelados en la cámara ien un tiempo t tal que dividido Ai, se obtiene su densidad ρi(t).
Este cociente se utilizó durante todo este trabajo para cuantificar el factor de concentración, de algún tipo de nadador,
en la cámara 2 y permitiendo así comparar la variación del efecto ratchet para distintos parámetros. En particular, si r=1,
es decir ρ1=ρ2, se dice que el dispositivo no rectifica y por lo tanto, no existe una dirección preferencial que separe y
concentre a la población.
Para obtener una mejor estadística de la rectificación, se promedia entre mrealizaciones con las mismas condiciones
iniciales pero distintas semillas (inicializadores) del generador de números pseudo-aleatorios utilizado en el modelo feno-
menológico. Luego, para encontrar el valor medio de la rectificación se tiene que descartar el período de transición para
promediar solo en el estado estacionario. Es decir, ⟨r⟩t=1
tfRtf
teq ⟨r(t)⟩mdt con teq el tiempo correspondiente al inicio del
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estado estacionario y tfel tiempo final de corrida.
Para realizar las simulaciones, los parámetros del microdispositivo a utilizar en este trabajo, consisten en un barrido
de No=[2-20] obstáculos con lfsegún la Ec. (3) tal que se mantenga un ancho máximo Lx=3 mm y un largo máximo
Ly=6mm, junto con una abertura lg=10 µm y un ancho tanto de pared como de obstáculo, ww=wf= 50 µm. No todos
los valores de Noutilizados son relevantes para ser replicados en laboratorio, sino que su finalidad es dejar en evidencia
el efecto de este parámetro (No) en los resultados de la rectificación. En una segunda instancia, con No=6, para los
micronadadores rápidos, se varía el tiempo medio de cambio de dirección (τCHD = [2-10] s) y, por otro lado, el porcentaje
de mezcla de población con τCHD =2 s y τCHD =10s.
Para resolver la Ec. (1) se utilizará el método de Euler con un paso ∆t=0.0001s aproximando el cuerpo de los
micronadadores por discos de radio R (Tabla 1). Para simplificar el análisis, las dos poblaciones de coanoflagelados se
simulan por separado, dado que se estudia un sistema muy diluido. Los valores de rectificación no presentan diferencias
significativas a los obtenidos con poblaciones mezcladas (zoom circular en la Fig. 2).
III. RESULTADOS DE LAS SIMULACIONES
Rectificación vs. número de obstáculos
En la Fig. 2se observa la rectificación en función del tiempo para los micronadadores lentos (verde) y los microna-
dadores rápidos (violeta) tanto para 6 como 20 obstáculos. Se puede notar que para tiempos mayores a 60 min (círculo
celeste), las curvas de rectificación de células rápidas alcanzan estados estacionarios con un factor de concentración entre
3 y 6 veces más en la cámara 2 que en la cámara 1. Mientras que las células lentas aún no han alcanzado a pasar a la
cámara superior, y por lo tanto, muestran valores de rectificación cercanos a cero.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.1 1 10 100 1000
t= 60 min
Rectificación r = ρ2/ ρ1
Tiempo [min]
FIG. 2: Rectificación en función del tiempo para No=6(colores oscuros) y No=20 (colores claros) para micronadadores lentos (verde)
y micronadadores rápidos (violeta). En los círculos a izquierda se muestran las rectificaciones de una población de micronadadores
rápidos y lentos simulados en conjunto (color gris) y por separado (color) para No=6.
Estos resultados muestran que existe una clara ventana de tiempo experimental, independiente de No, que permite
extraer una población casi pura de micronadadores rápidos en un intervalo de tiempo ∆t=60 min. Para el caso de los
micronadadores lentos se puede notar que inclusive con tiempos de simulación de 30h, aún no alcanzan el estado esta-
cionario y no rectifican. Este resultado lleva a poner el foco del análisis en la población de los micronadadores rápidos,
debido a que tiempos mayores a 5h, se producen cambios biológicos como falta de nutrientes, división celular, entre otros.
Seguidamente, se realiza la simulación para una misma población de micronadadores rápidos, variando Node 2 a 20
obstáculos. En la Fig. 3, se muestra la rectificación en función del número de obstáculos, alcanzando un valor máximo,
r= (7.9±0.2), para No=2 y un valor mínimo, r= (3.03 ±0.06), para No=20. Estos resultados describen una relación
cuadrática entre Noy la rectificación (ver ajuste en Fig. 3).
En cuanto a la diferencia en los valores de rectificación según el número de obstáculos se tienen distintos factores,
dependientes entre sí, para analizar: ruptura de simetría,número de canales a atravesar ylargo de pared a recorrer.
Al proponer un microdispositivo de ancho fijo, la restricción en su geometría implica que al disminuir Nose deba co-
locar obstáculos de mayor tamaño, aumentando el efecto de ruptura de simetría, y por lo tanto, una dirección de nado
preferencial. Luego, si se considera que la mayoría de los micronadadores tipo pusher prefieren nadar cerca de las pa-
redes [9,10], entonces al aumentar lf, se genera mayor camino a recorrer para el nadador. En cambio, si el lftendiera
a cero, hay menos camino para recorrer pero el número de aperturas sería cada vez mayor generando más posibilidades
de paso de una cámara a la otra. En otras palabras, dependiendo del número de obstáculos, se aumenta o disminuye la
probabilidad de pasar de una cámara a otra, y por lo tanto, varían los valores de rectificación.
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2
3
4
5
6
7
8
9
0 4 8 12 16 20
Rectificación r = ρ2 / ρ1
No
r =0.09(No−2.2)2 + 8.6
7.9 ± 0.2
3.03 ± 0.06
FIG. 3: Rectificación de nadadores rápidos vs. el número de obstáculos del microdispositivo. La función de ajuste está incluida en la
figura. Se indica, para No=2y No=20, la media y el error de la rectificación.
Rectificación vs. tiempo medio de cambio de dirección
La evidencia experimental nos indica que toda población tiene respuestas cambiantes en su movilidad frente a distintos
quimioatractantes, gradientes de oxígeno, distribución heterogéneas de alimentos, etc. Esto se ve reflejado en la frecuencia
2
3
4
5
6
7
2 4 6 8 10
No= 6
Rectificación r = ρ2/ ρ1
τCHD [s]
r= 1.4+2.2ln(τCHD)
(a)
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100
No= 6
CHD
Rectificación r = ρ2/ ρ1
% nadadores rápidos con τ =10s, x
r =2.7+0.04x
(b)
FIG. 4: (a) Rectificación de micronadadores rápidos vs. τCHD . (b) Rectificación vs. el porcentaje de población de nadadores rápidos
con τCHD = 10 s. Para (a)-(b), No=6y se muestran las funciones de ajuste.
de cambio de dirección de nado τCHD , es decir el aumento o disminución de tiempo en que el microorganismo se mueve
en forma aproximadamente lineal, permitiendo encontrar ambientes más favorables. De esta manera resulta interesante
estudiar la rectificación simulando grupos celulares con diferentes capacidades de reacción a los estímulos [8,11,12].
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En la Fig. 4(a) se presenta la rectificación en función de τCHD para una población N de micronadadores rápidos con
No=6. Se observa que los valores de rectificación pueden ser ajustados a una función logarítmica dependiente de τCHD .
Además entre τCHD =2s y τCHD =10 s, la diferencia entre las rectificaciones supera el 100%. Por otra parte, teniendo en
cuenta que la intensidad de estos cambios puede no ser homogénea en una población celular, se analiza la rectificación en
función de una respuesta de taxis heterogénea. Para producir ese efecto, se varía el porcentaje de población con τCHD =10s
yτCHD =2s.
La Fig. 4(b) muestra la rectificación en función del porcentaje de población heterogénea de nadadores rápidos con
τCHD =10s y τCHD =2 s en un microdispositivo con No=6. Los resultados muestran un crecimiento lineal con una tasa
de variación constante. Esto evidencia que las poblaciones celulares con mayor porcentaje de individuos sensibles a los
cambios del ambiente, rectifican de manera más eficiente.
IV. CONCLUSIONES
Este trabajo ha planteado un modelo fenomenológico que resulta eficiente para representar cualitativamente la dinámica
de coanoflagelados. Se utilizaron parámetros geométricos funcionales para una futura fabricación y manejo del microdis-
positivo sin perder los detalles a nivel microscópico. Como así también, se ha agregado una condición de inoculación
práctica para la realización del experimento.
Además se propusieron diversos microdispositivos para concentrar y separar con éxito a una población mixta de coano-
flagelados. Esto se logró en una ventana de tiempo realizable experimentalmente de 60 min. Resultando independiente de
la geometría específica propuesta, es decir, de 6 a 20 obstáculos. Con respecto a los valores de rectificación se obtuvo un
factor de eficiencia de 6.5 para 6 obstáculos, más del doble del valor obtenido para 20 obstáculos.
Aprovechando las ventajas de las simulaciones, se extendió el análisis de la rectificación para un amplio rango de
números de obstáculos, No. Los resultados presentaron un incremento en la rectificación a medida que disminuye No, con
un valor máximo de eficiencia de casi 8 para 2 obstáculos.
Se estudió la rectificación frente a distintos comportamientos biológicos por respuestas de taxis teniendo en cuenta
los casos en el que la conducta fuera homogénea o heterogénea en la población. Se observó en ambos casos, que las
poblaciones con mayor τCHD rectifican más.
En resumen, en este trabajo se obtuvo un microdispositivo capaz de separar y concentrar con un factor de eficiencia
mayor a 3 y en un tiempo experimentalmente realizable para un rango de modelos biológicos. Esto incentiva la realización
de experimentos con distintas poblaciones en el microdispositivo para cuantificar y comparar los fenómenos de transporte
en la búsqueda de generar distintas aplicaciones biotecnológicas.
AGRADECIMIENTOS
A P. Pury y M. Bettera Marcat por las útiles discusiones. Financiamiento Secyt-UNC, PICT-2020-SERIEA-02931 y
PICT-2020-2594.
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