Anales AFA Vol. 35 Nro. 4 (Diciembre 2024 - Marzo 2025) 84-86
ESTUDIO DEL PROCESO DE COAGULACIÓN SANGUÍNEA MEDIANTE LA TÉCNICA
DE BIOSPECKLE
STUDY OF THE BLOOD COAGULATION PROCESS BY MEANS OF THE BIOSPECKLE
TECHNIQUE
G. Detarsio*1, M. Raviola1, L. Tendela2,3, A. Pratti1, B. D. Riquelme1,2 y G. Galizzi2,3
1Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas – Universidad Nacional de Rosario
Suipacha 535 – (2000) Rosario – Argentina
2Instituto de Física de Rosario – CONICET-UNR
Bv. 27 de febrero 210 bis – (2000) Rosario – Argentina
3Facultad de Cs. Exactas, Ingeniería y Agrimensura – Universidad Nacional de Rosario
Pellegrini 250 – (2000) Rosario – Argentina
Recibido: 06/05/2024 ; Aceptado: 30/10/2024
En este trabajo se utilizó un enfoque experimental para evaluar la utilidad de la técnica de biospeckle en el estudio del
proceso de coagulación sanguínea. Se analizaron los tiempos de tromboplastina parcial con activador en plasma normal,
plasma con deficiencia de Factor VIII y la mezcla de ambos. Los resultados muestran una correlación entre los cambios
en los patrones de speckle y la formación de la malla de fibrina en las muestras normal y patológica. En consecuencia,
la técnica de biospeckle puede ser una herramienta útil para evaluar la hemostasia y los cambios que se generan en la
polimerización de la fibrina frente a deficiencias o interferencias.
Palabras Clave: biospeckle, coagulación sanguínea, THSP, coeficiente de correlación, procesamiento de señales.
In this work, an experimental approach was used to evaluate the usefulness of the biospeckle technique in the study
of the blood coagulation process. Partial thromboplastin times with activator were analyzed in normal plasma, Factor
VIII-deficient plasma, and a mixture of both. The results show a correlation between changes in speckle patterns and
fibrin mesh formation in normal and pathological samples. Consequently, the biospeckle technique can be a useful tool
to evaluate hemostasis and the changes generated in fibrin polymerization in the face of deficiencies or interferences.
Keywords: biospeckle, blood coagulation, THSP, correlation coefficient, signal processing.
https://doi.org/10.31527/analesafa.2024.35.4.84 ISSN - 1850-1168 (online)
* galizzi@ifir-conicet.gov.ar
©2024 Anales AFA 84
I. INTRODUCCIÓN
Cuando una superficie ópticamente heterogénea se ilumina con un haz de luz láser, la luz dispersada forma un patrón
de manchas claras y oscuras distribuidas de manera aleatoria. Tal distribución, que también se observa cuando la luz
coherente se propaga a través de un medio que presenta variaciones aleatorias en su índice de refracción, se conoce como
patrón de speckle. Cuando el medio que provoca la dispersión presenta variaciones en su estructura microscópica, el patrón
de speckle generado varía con el tiempo. En particular, cuando el medio dispersor es de naturaleza biológica, el patrón
de speckle se denomina biospeckle. La técnica basada en el estudio de la evolución temporal del biospeckle se denomina
BSL y permite analizar el comportamiento dinámico de la muestra y caracterizar los parámetros que intervienen en el
proceso biológico subyacente [1-3].
La sangre humana está constituida por elementos formes (leucocitos, eritrocitos y plaquetas) y plasma que, además de
agua, contiene sales y un gran número de biomoléculas [4]. En condiciones normales circula por los vasos sanguíneos
en estado líquido, pero ante una lesión forma un tapón sólido para sellar la herida y evitar el sangrado. En este proceso,
que recibe el nombre de coagulación, están involucradas proteínas plasmáticas llamadas factores de la coagulación. El
primero de estos factores en ser reconocido fue el fibrinógeno. Las proteínas que circulan en el plasma en forma inactiva
son capaces de activarse por un mecanismo muy eficiente conocido con el nombre de mecanismo de cascada. Como
resultado final de este proceso la Protrombina es transformada en su forma activa, la Trombina. Finalmente, el fibrinógeno
se transforma por acción de la trombina en fibrina insoluble, la cual polimeriza y genera la red proteica que consolida la
estructura del coágulo [4].
Existen diferentes patologías en las cuales la formación del coágulo se ve alterada a causa de alguna deficiencia en los
Factores de la Coagulación. Esto produce una enfermedad hemorrágica de las cuales la más estudiada es la Hemofilia.
Según sea su característica puede clasificarse en Hemofilia A (deficiencia en la síntesis del factor FVIII) o Hemofilia B
(deficiencia en la síntesis del factor FIX) [5].
El objetivo de este trabajo fue evaluar la utilidad de la técnica BSL para evidenciar los cambios de índice de refracción
que ocurren en el plasma humano normal durante el proceso de formación de la malla de fibrina, y las posibles modifi-
caciones de dicho fenómeno óptico cuando se utilizan plasmas de pacientes con Hemofilia A. Además, evaluar por BSL
si dichas alteraciones pueden ser corregidas al aportar FVIII al plasma deficiente mezclando, en partes iguales, plasma
deficiente con plasma normal.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
En esta primera etapa se utilizó la técnica BSL para evaluar el proceso de coagulación en muestras de plasma recolec-
tadas cumpliendo los requerimientos de la Comisión de Bioética de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
de la UNR (Resol. 523/2017). Se procesaron un pool de plasma normal proveniente de 10 dadores sanos con una edad
comprendida entre 18 y 45 años (PN), plasma de un paciente con hemofilia A (PD) y la mezcla de ambos (PM). Las
muestras se obtuvieron por punción venosa y la sangre se recogió en tubos con citrato de sodio (3,2%) en relación de 1
parte de anticoagulante y 9 partes de sangre (1:9). Los tubos se centrifugaron durante 10 minutos a 2.500g y se separó el
plasma sobrenadante. Para activar la formación del coágulo se realizó la prueba de Tiempo de Tromboplastina Parcial con
Activador (TTPA) que consiste en agregar al plasma, un reactivo activador de la coagulación y cloruro de calcio 0.025M.
En una cubeta de poliestireno de fondo redondo, alineada con el sistema de medición, se pipetearon, 100 ul de plasma y
100 ul de reactivo de TTPA (Actin FSL de Siemens). Luego de dos minutos de incubación, se agregaron 100 ul de cloruro
de calcio y se activa la adquisición de imágenes.
Dispositivo experimental
La Fig. 1muestra un esquema del dispositivo experimental utilizado. La luz proveniente de un láser de HeNe (longitud
de onda 633 nm, potencia 60 mW) ilumina la muestra (M). La intensidad de la luz dispersada que atraviesa la muestra
es registrada con un sistema basado en una cámara de vídeo tipo CCD, la cual se programó para adquirir 25 imágenes
por segundo. Este sistema digitaliza las imágenes adquiridas por la cámara en 256 niveles de gris con una resolución
de 256×256 píxeles y permite almacenarlas en una computadora personal (PC). Es necesario resaltar que la cámara no
posee un sistema de lentes formador de imágenes. En consecuencia, el patrón de speckle adquirido se denomina speckle
objetivo, pues depende únicamente de las características globales de la totalidad de la muestra y de la posición del plano
de observación respecto a la misma. Por lo tanto, cada punto del detector recibe la contribución de todos los puntos
iluminados de la muestra.
Cada muestra fue analizada durante 200 segundos, es decir, se adquirieron 5000 imágenes. Para evitar interferencias de
vibraciones mecánicas externas, el sistema experimental se montó sobre una mesa óptica anti vibratoria. Los experimentos
se realizaron en una habitación con temperatura controlada de 24ºC.
Análisis de datos
Las imágenes adquiridas para cada muestra se agruparon en una matriz Ide 256×256×5000 elementos, donde las dos
primeras dimensiones representan las coordenadas espaciales de un dado píxel y la tercera dimensión corresponde al
número de imagen adquirida dentro de la secuencia correspondiente, o de manera equivalente, al momento de adquisición
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FIG. 1: Esquema del dispositivo experimental indicando el láser, la muestra analizada (M), la cámara (CCD) y la computadora
personal (PC).
de esa imagen.
Para el análisis de la coagulación mediante BSL se emplearon los siguientes parámetros: intensidad media IM, historia
temporal del patrón de speckle (THSP), y actividad relativa AR. La intensidad media IM(k)se define como 1:
IM(k) = ⟨I(k)⟩(1)
donde I(k)es la matriz compuesta por los niveles de gris de los píxeles correspondientes a la imagen ky⟨.⟩denota el
operador valor medio, es decir, el promedio aritmético de los elementos de la matriz I(k). El valor de IMpuede relacionarse
con la mayor o menor transparencia de la muestra, es decir, mientras mayor es el valor de IMmás transparente es la
muestra.
La historia temporal del patrón de speckle (THSP) es una matriz que muestra la variación temporal de la intensidad de
un grupo de píxeles a lo largo del experimento [1,6]. Cada fila de la THSP es la intensidad de un píxel determinado y cada
columna es el momento en que fue registrada esa intensidad. De esta manera, la mayor actividad en un píxel corresponde
a líneas horizontales cortas, mientras que la actividad baja corresponde a líneas horizontales largas. En este trabajo, los
puntos que constituyen la THSP fueron seleccionados aleatoriamente en base a una distribución gaussiana bidimensional
alrededor del píxel central de las imágenes de BSL.
La actividad relativa AR(k,k0)entre las imágenes kyk0está definida como:
AR(k,k0) = 1−CC(k,k0)(2)
donde CC(k,k0)es el coeficiente de correlación definido como [7]:
CC(k,k0) = ⟨(I(k)I(k0))⟩−⟨(I(k)⟩⟨I(k0)⟩)
p(⟨I2(k)⟩−⟨I(k0)2⟩)(⟨I2(k)⟩−⟨I(k0)2⟩)(3)
AR(k,k0)evalúa la actividad comparando la imagen kcon una imagen k0considerada como referencia. En nuestro caso
k0=k−25, es decir, se calculó ARentre la imagen ky la imagen adquirida un segundo antes. La disminución de la
actividad de la muestra se traduce en un valor pequeño de AR.
III. RESULTADOS
La Fig. 2muestra la evolución temporal de IMpara la muestra normal (PN), patológica (PD) y la mezcla de ambas
(PM). Para el caso de las muestras PN y PM, puede verse que IMdisminuye a partir de los 110 s aproximadamente, siendo
esta disminución más pronunciada para el caso de PN. Por otra parte, en el caso de PD la disminución de IMse observa
a partir de los 150 s aproximadamente. El decrecimiento de IMestá asociado al momento de formación de la malla de
fibrina y al tiempo de coagulación.
La Fig. 3muestra la THSP correspondiente a PN (a), PD (b) y PM (c). Puede observarse que las muestras PN y PM
disminuyen su actividad a partir de los 110 s aproximadamente, ya que después de dicho tiempo se observan líneas
horizontales largas. Por otro lado, en el caso de PD este fenómeno se observa a partir de los 150 s aproximadamente.
En la Fig. 4se observa la evolución temporal de ARpara las tres muestras. En los primeros 15 s, todas las muestras
experimentan una gran actividad debido a la turbulencia ocasionada por la introducción del cloruro de calcio. Sin embargo,
se observa que la muestra PN disminuye rápidamente su actividad relativa antes de los 50 s, y no muestra actividad
luego de los 110 s aproximadamente. Las muestras PD y PM muestran una disminución de AR menos pronunciada. La
muestra PM detiene su actividad a los 110 s aproximadamente, mientras que la muestra PD lo hace a partir de los 150 s
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FIG. 2: Intensidad media IMcorrespondiente a las muestras PN (azul), PD (amarillo) y PM (negro).
FIG. 3: THSP correspondiente a (a) PN, (b) PD y (c) PM.
aproximadamente.
Los resultados de los tres parámetros permiten diferenciar claramente el comportamiento de las muestras normal y
patológica, observándose cómo este se acerca al normal cuando se mezcla en partes iguales el plasma deficiente con el
plasma normal. Además, las gráficas analizadas de los parámetros propuestos brindan valores cuantitativos de los tiempos
característicos de cada muestra.
IV. CONCLUSIONES
En este trabajo se analizaron los tiempos de tromboplastina parcial con activador en plasma normal, plasma con de-
ficiencia de Factor VIII y la mezcla de ambos. Los resultados obtenidos en esta evaluación preliminar sugieren que la
técnica BSL puede ser una herramienta útil para evaluar la hemostasia y los cambios que se generan en la polimerización
de la fibrina frente a deficiencias o interferencias. Dichos resultados permitieron diferenciar claramente el comportamiento
de las muestras normal y patológica.
REFERENCIAS
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FIG. 4: Actividad relativa ARcorrespondiente a las muestras PN (azul), PD (amarillo) y PM (negro).
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[3] M. A. Toderi, B. D. Riquelme y G. E. Galizzi. An experimental approach to study the red blood cell dynamics in a capillary tube
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