Anales AFA Vol. 35 Nro. 4 (Diciembre 2024 - Marzo 2025) 103 - 106
DISEÑO DE INTERFAZ EN LENGUAJE PYTHON PARA EL ANÁLISIS DE
MICROFOTOGRAFÍAS: APLICACIÓN A LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
HEMORREOLÓGICA DE QUERCETINA
PYTHON INTERFACE DESIGN FOR MICROPHOTOGRAPHY ANALYSIS:
APPLICATION TO EVALUATE THE HEMORHEOLOGICAL ACTIVITY OF
QUERCETIN
P. Buszniez1, M. Gómez1, H. V. Castellini2y B. D. Riquelme*1,3,4
1Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR) - Suipacha 531, Rosario – Argentina
2Facultad de Cs. Exactas, Ingeniería y Agrimensura (UNR) – Rosario – Argentina
3Grupo de Física Biomédica, Instituto de Física Rosario (CONICET-UNR) – Rosario – Argentina
4Consejo de Investigaciones de la UNR – Argentina
Recibido: 06/06/2024 ; Aceptado: 01/09/2024
En este trabajo se describe el desarrollo de una GUI (Graphic User Interface) en Python para sistematizar el análisis de
imágenes, en el marco del estudio hemorreológico in vitro de fitoquímicos que podrían ser utilizados en el tratamiento de
la diabetes. Los criterios de usabilidad de la GUI basada en la librería TkInter están dirigidos a usuarios no expertos. Los
algoritmos de procesamiento de imágenes están contenidos en la biblioteca OpenCV2, que utiliza las redes neuronales
previamente entrenadas. Las imágenes se obtuvieron con una cámara digital acoplada a un microscopio invertido y
objetivo 40x. En este trabajo se optimizó el proceso de búsqueda de parámetros (porcentajes de células aisladas y el
coeficiente de células aisladas) para glóbulos rojos incubados con soluciones de quercetina a distintas concentraciones.
Palabras clave: interfaz gráfica de usuario, python, quercetina, diabetes.
This work describes the development of a GUI (Graphic User Interface) in Python to systematize the image analysis
within the framework of the in vitro hemorheological study of phytochemicals that could be used for diabetes treatment.
The usability criteria of the GUI based on the TkInter library are aimed at non-expert users. The image processing
algorithms are contained in the OpenCV2 library, which uses pre-trained neural networks. Images were obtained using
a digital camera coupled to an inverted microscope (40x objective). In this work, the parameter search process was
optimized (percentages of isolated cells and the coefficient of isolated cells) for red blood cells incubated with quercetin
solutions at different concentrations.
Keywords: graphic user interface, python, quercetin, diabetes.
https://doi.org/10.31527/analesafa.2024.35.4.103 ISSN - 1850-1168 (online)
* riquelme@ifir-conicet.gov.ar
©2024 Anales AFA 103
I. INTRODUCCIÓN
En condiciones normales, los glóbulos rojos en reposo se agregan en estructuras similares a pilas de monedas llama-
das rouleaux, pero en determinadas patologías, como por ejemplo la diabetes, forman aglomerados globulares llamados
clusters [1],[2]. Para simular in vitro las alteraciones que la hiperglucemia produce en pacientes diabéticos, se realizan in-
cubaciones de glóbulos rojos humanos en medios con diferentes concentraciones de glucosa. Además, mediante estudios
hemorreológicos es posible evaluar si determinados compuestos podrían revertir estas alteraciones a fin de utilizarlos para
el tratamiento de la diabetes [3],[4],[5].
En este tipo de estudios hemorreológicos se suelen utilizar imágenes digitales correspondientes a glóbulos rojos de
donantes sanos que fueron incubados con soluciones de glucosa (glicados in vitro) y luego tratados con el compuesto
en estudio, por ejemplo fitoquímicos (Trigonelina, quercetina, beta-sitosterol) o extractos de plantas nativas (Phyllanthus
sellowianus yBauhinia forficata) utilizadas para el tratamiento de la diabetes [6]. Por lo tanto, se necesita procesar
una gran cantidad de imágenes digitales de glóbulos rojos de dadores sanos, tratadas con los fitoquímicos e incubadas
en medios con distintas concentraciones de glucosa [7]. El protocolo con estas imágenes incluye la determinación de
los porcentajes de células aisladas (CA) y parámetros de agregación [8], [9]. En particular, se utiliza frecuentemente el
coeficiente de células aisladas definido de la siguiente manera:
CCA =
CAinicial −CAfinal
CAinicial (1)
Este coeficiente puede variar entre 0 y 1; siendo CCA =0 cuando no hay diferencias en la agregación antes y después del
tratamiento, y CCA =1 cuando hay agregación completa después del tratamiento. De esta forma, el valor de CCA cuantifica
la variación de la agregación de la muestra tratada relativa al control.
El objetivo de este trabajo fue optimizar el proceso de obtención de estos parámetros reduciendo el tiempo de trabajo
por imagen por parte del operador, mediante el desarrollo de un programa adecuado para el análisis de las microfotografías
de glóbulos rojos (GR) incubados con soluciones del fitoquímico quercetina.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se utilizaron muestras de sangre de dadores sanos obtenidas por punción venosa y anticoaguladas con EDTA. Los GR
fueron separados por centrifugación y lavados una vez en PBS (solución buffer fosfato, pH 7.4 y osmolaridad 300 mOsm)
para su posterior tratamiento.
Tratamiento de las células
Se utilizó quercetina adquirida de Laboratorio Sigma Aldrich (código117-39-5). Se prepararon soluciones de querceti-
na en PBS a distintas concentraciones (0,1; 1; 10 y 100 µM), las cuales fueron elegidas teniendo en cuenta las utilizadas
en diversos estudios de investigación y su solubilidad en agua (ensayos previos demostraron que a concentraciones su-
periores a 100 µMes poco soluble en agua). En esta publicación se describen los efectos obtenidos en función de las
concentraciones de quercetina utilizadas:
Bajas dosis 0 a 10 µM: quimioprevención.
Dosis medias 10 a 200 µM: efectos mixtos.
Dosis altas >200 µM: pro-oxidante o potenciales propiedades terapéuticas.
Volúmenes iguales de GR lavados y de cada solución de quercetina fueron mezclados e incubados a 37°C durante 2
horas con agitación controlada. Luego los GR fueron lavados nuevamente con PBS y resuspendidos en plasma autólogo
al 0,3% para su observación y toma de imágenes por quintuplicado en el microscopio.
Método
Se desarrolló una GUI (Graphic User Interface) en Python para sistematizar el análisis de imágenes digitales tomadas
con una cámara acoplada a un microscopio invertido y objetivo 40x. El programa desarrollado permite aplicarles un
balance de blancos para mejorar el contraste células-fondo y realizar el conteo de las células totales (incluidas aquellas
que no se encuentran aisladas, sino formando rouleaux). Además, se diseñó una interfaz on-click para facilitar el manejo
del programa a operarios no familiarizados con recursos informáticos.
Los criterios de usabilidad de la GUI basada en la librería TkInter están dirigidos a usuarios no expertos. Los algoritmos
de procesamiento de imágenes están contenidos en la biblioteca OpenCV2, que utiliza las redes neuronales previamente
entrenadas por la empresa INTEL (https://opencv.org/).
III. RESULTADOS
En la Fig. 1se muestra un ejemplo de una de las imágenes originales obtenidas para los GR incubados con quercetina.
La interfaz desarrollada permite utilizar imágenes digitalizadas de forma práctica e incluso remota.
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FIG. 1: Imagen original de GR incubados con la solución de quercetina 100 µM, obtenida con una cámara acoplada a un microscopio
invertido y objetivo 40x.
En la Fig. 2se muestra la misma imagen ecualizada por el programa usando la biblioteca “Python Imaging Library”
(https://python-pillow.org/). En la Fig. 3se puede observar la imagen post conteo donde cada glóbulo rojo incluido en el
conteo es indicado por el programa con su circunferencia teñida de azul.
FIG. 2: Imagen ecualizada por el programa usando la biblioteca “Python Imaging Library” (https://python-pillow.org/).
FIG. 3: Imagen post conteo. Cada glóbulo rojo incluido en el conteo es indicado por el programa con su circunferencia teñida de azul.
La interfaz da el conteo y las relaciones del total de células con las células aisladas a través de un histograma, incluyendo
las agrupadas en rouleaux o clusters. En la Fig. 4se presenta la visualización en la barra de estado del resultado del conteo
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informado por el programa, el cual puede guardarse como un documento.
FIG. 4: El resultado del conteo se informa en el programa y puede guardarse como un documento.
En la Fig. 5se observa a través del histograma emitido, el número y frecuencia de agregados eritrocitarios según la
cantidad de células que los componen (Tamaño de rouleaux), en relación con las células aisladas.
El código desarrollado optimiza las imágenes en el caso de los clusters, empleando un balance de blancos. El proceso
asegura que el contraste entre la célula y el fondo sea tal que garantice una interpretación significativa del fenómeno de la
agregación de eritrocitos.
FIG. 5: Histograma obtenido con la relación de CAy distintos grupos de agregados eritrocitarios.
Con los valores obtenidos se calcula el coeficiente de células aisladas (CCA) que se define como la diferencia entre los
porcentajes de células individuales iniciales (GRs control) y finales (GRs tratados) con relación al porcentaje de células
individuales antes del tratamiento, de acuerdo con la ecuación (1).
En la Tabla 1se presentan los parámetros de agregación eritrocitaria (porcentaje de células aisladas y CCA) obtenidos a
partir de las imágenes de las muestras de glóbulos rojos tratados con quercetina.
TABLA 1: PARÁMETROS DE IMÁGENES OBTENIDOS PARALAS MUESTRAS DE GLÓBULOS ROJOS TRATADOS CON DISTIN-
TAS CONCENTRACIONES DE QUERCETINA.
Muestra [CA] CCA
CONTROL 82,3 0
Q 0,1 µM72,5 ±3,6*** 0,120 ±0,006
Q 1 MM56,4 ±2,8*** 0,31 ±0,02*
Q 10 MM55,6 ±2,8*** 0,33 ±0,02*
Q 100 MM37,6 ±1,9*** 0,54 ±0,03*
*p-valor<0,05; **p-valor<0,001; ***p-valor<0,0001
La disminución del CAy el aumento de CCA muestran que a mayores concentraciones de quercetina se forman agregados
de mayor tamaño, es decir conformador por una mayor cantidad de células.
IV. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se pudo optimizar el proceso de obtención de los parámetros de agregación eritrocitaria mediante
un programa adecuado para el análisis de las microfotografías de glóbulos rojos incubados con soluciones de quercetina.
El código desarrollado será de gran ayuda para el análisis de imágenes obtenidas por microscopía de glóbulos rojos
tratados in vitro con soluciones de quercetina como así también de otros fitoquímicos y extractos vegetales. Este nuevo
diseño será de utilidad además para el análisis de las imágenes obtenidas por microscopía de muestras de lóbulos rojos de
pacientes y de muestras tratadas in vitro con diferentes drogas de interés farmacéutico.
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REFERENCIAS
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[2] M. Delannoy, A. Fontana, M. D’Arrigo y B. Riquelme. Influence of hypertension and type 2 diabetes mellitus on erythrocyte
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uploads/Archive2015-1/5-10_Delannoy.pdf.
[3] C. Chang, Y. Lin, A. Bartolome, Y. C. Chen, S. C. Chiu y W. C. Yang. Herbal Therapies for Type 2 Diabetes Mellitus: Chemistry,
Biology, and Potential Application of Selected Plants and Compounds. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine
33 (2013). http://www.hindawi.com/journals/ecam/2013/378657/.
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