APLICACIONES DE FLIM-FRET Y DE MICROSCOPÍA DE FUORESCENCIA 3D EN INMUNOHEMATOLOGÍA

Resumen

Mediante la técnica de FRET se caracterizó la aglutinación de glóbulos rojos (GR) usando fluoróforos localizados en la membrana celular (DiI) y fluoróforos (Alexa488TM) combinados por marcado secundario con anticuerpos monoclonales anti-Glicoforina A, B y C (GPA, GPB y GPC). El análisis por FLIM fue utilizado para discriminar la señal de FRET de las moléculas cuando había superposición de su emisión espectral. Se extrajeron los lípidos de la membrana de GR con Triton X-100 y se analizaron las interacciones GP-citoesqueleto por microscopía de fluorescencia 3D. Dada las propiedades fluorescentes en los GR del par Alexa488TM (donor) y DiI (aceptor), se espera observar un FRET efectivo cuando hay aglutinación de GR.
FLIM en estado dinámico permite evaluar el mecanismo subyacente del proceso de transferencia de energía en los GR aglutinados. Los resultados demuestran que para excitación a 780nm, sólo se observa FLIM-FRET desde el fluoróforo Alexa488TM al DiI para los anti-GPB, con una distribución de tiempo de vida en el rango de los picosegundos, no observándose un FRET efectivo para los anti-GPA. La microscopía de imágenes fluorescentes 3D mostró interacciones tanto entre el citoesqueleto con las GPC como con las GPB pero no con las GPA. Estos resultados revelados sólo por estas técnicas, comprueban la importancia de la reactividad específica de los anticuerpos monoclonales utilizados con las Glicoforinas A, B o C.